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PCR需要注意的一些問(wèn)題
擴(kuò)增長(zhǎng)目的片段當(dāng)擴(kuò)增大于5kb的目的片段時(shí)，可以使用用于超長(zhǎng)PCR的酶或酶混合物以獲得*產(chǎn)量）。Taq DNA聚合酶并不能有效擴(kuò)增較長(zhǎng)目的片段（大于5kb），可能是因?yàn)槠淙鄙?'-5'外切核酸酶活性，不能糾正dNTP錯(cuò)誤摻入。錯(cuò)誤配對(duì)的延伸幾率大大降低，減少了較長(zhǎng)產(chǎn)物的產(chǎn)量。將Taq DNA聚合酶同帶有3'-5'外切核酸酶活性的熱穩(wěn)定DNA聚合酶混合，可以擴(kuò)增zui高為30kb的目的片段。Platunum Pfx DNA聚合酶（帶有3'-5'外切核酸酶活性）也可以擴(kuò)增較長(zhǎng)產(chǎn)物（≤12kb）。除了選用正確的熱穩(wěn)定DNA聚合酶，較長(zhǎng)產(chǎn)物的擴(kuò)增還需要改變標(biāo)準(zhǔn)步驟的延伸時(shí)間、變性時(shí)間、緩沖液pH。按1分鐘/kb增加延伸時(shí)間使聚合酶完成合成。一般對(duì)于有效的超長(zhǎng)PCR，延伸溫度會(huì)低至68℃。因?yàn)檠由鞎r(shí)間較長(zhǎng)，對(duì)于20kb的模板高達(dá)20分鐘，所有使用較高起始pH的緩沖液。如果pH將至低于pH7.0，DNA會(huì)脫嘌呤。為了防止模板損傷，在每個(gè)循環(huán)將94℃變性時(shí)間減少到30秒或更短，將在擴(kuò)增前溫度增加到94℃變性溫度的時(shí)間限制為小于等于1分鐘。引物使用標(biāo)準(zhǔn)方法所使用的同樣的方法設(shè)計(jì)，使用18到24個(gè)堿基得到較好的產(chǎn)量。防止殘余（Carry-over）污染PCR易受污染的影響，因?yàn)樗且环N敏感的擴(kuò)增技術(shù)。小量的外源DNA污染可以與目的模板一塊被擴(kuò)增。當(dāng)前一次擴(kuò)增產(chǎn)物用來(lái)進(jìn)行新的擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)，會(huì)發(fā)生共同來(lái)源的污染。這稱(chēng)之為殘余污染。從其他樣品中純化的DNA或克隆的DNA也會(huì)是污染源。可以在PCR過(guò)程中使用良好的實(shí)驗(yàn)步驟減少殘余污染。使用抗氣霧劑移液管的阻止氣霧劑進(jìn)入eppendorf管內(nèi)。為PCR樣品配制和擴(kuò)增后分析設(shè)計(jì)隔離的區(qū)域，在準(zhǔn)備新反應(yīng)前更換手套。總是使用不含有模板的陰性對(duì)照檢測(cè)污染。使用預(yù)先混合的反應(yīng)成分，而不是每個(gè)反應(yīng)的每個(gè)試劑單獨(dú)加入。一種防止殘余污染的方法是使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）。這種酶（也稱(chēng)為尿嘧啶-N-糖基化酶或UNG）移除DNA中的尿嘧啶。在擴(kuò)增過(guò)程中將脫氧尿嘧啶替換為胸腺嘧啶使得可以把前面的擴(kuò)增產(chǎn)物同模板DNA區(qū)分開(kāi)來(lái)。因?yàn)榍懊娴臄U(kuò)增產(chǎn)物對(duì)UDG敏感，所有可以在PCR前對(duì)新配制的反應(yīng)用UDG處理以破壞殘余產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物純化殘余反應(yīng)成分包括抑制克隆，測(cè)序和標(biāo)記反應(yīng)的引物，核苷和熱穩(wěn)定聚合酶。因此，一般在進(jìn)一步操作之前需要純化PCR產(chǎn)物。包括多次酚：氯仿抽提及隨后的PEG沉淀或異丙醇沉淀的純化步驟雖然有效，但是耗費(fèi)時(shí)間，且會(huì)丟失產(chǎn)物。Maligen Rapid PCR Purification System在10分鐘內(nèi)從反應(yīng)成分中純化PCR產(chǎn)物。它對(duì)80bp到10kb很大范圍的PCR片段都有效，有效回收95％的原有樣品（圖26）。擴(kuò)增后PCR片段的純化使用1.2μg引物（泳道1）或3.5μg引物（泳道2）。峰值包含約1μg擴(kuò)增產(chǎn)物的完整PCR體系。引物36到40堿基長(zhǎng)。將峰值反應(yīng)純化，對(duì)純化前（泳道A）和純化后（泳道B）的洗脫液水相使用瓊脂糖凝膠電泳分析。部分PCR產(chǎn)物可能需要通過(guò)凝膠電泳，和影響克隆和測(cè)序的非特異性PCR產(chǎn)物分離純化出來(lái)。使用Maligen Gel Extraction System將目的產(chǎn)物從瓊脂糖中純化出來(lái)，這是一種基于硅土的，從凝膠中快速純化DNA片段的技術(shù)。